Botulismin diagnoosi perustuu Clostridium-botuliinitoksiinin tunnistamiseen laboratoriossa ja kliinisten oireiden havaitsemiseen, vaikka ne olisivat joskus epäspesifisiä. Itse asiassa tauti voidaan sekoittaa Guillain-Barré-oireyhtymän, poliomyeliitin, aivohalvauksen, myasthenia graviksen ja punkkien halvaantumisen kanssa.
Elintarvikkeiden botulismissa tärkeitä vihjeitä ovat kuva hermosolujen häiriöistä ja mahdollisesti saastuneen ruoan nauttimisesta. Samanaikainen ilmentyminen vähintään kahdella potilaalla, jotka söivät samaa ruokaa, helpottavat diagnoosia. Vahvistus saadaan eristämällä mikro-organismi potilaan epäilyttävien elintarvikenäytteiden tai ulosteiden viljelykokeen kanssa ja tunnistamalla botuliinitoksiinia elintarvikkeissa tai biologisissa materiaaleissa (kuten veressä, mahalaukussa ja oksennuksessa).
Haavan botulismissa toisaalta seerumin toksiinin diagnoosi tai Clostridium botulinum -eristys eristetään ihovaurionäytteestä.
